Fondato dai vescovi lombardi nel 1854, il Pontificio seminario lombardo ha ricevuto l'approvazione di papa Leone XIII con il breve In supremo del 15 dicembre 1890.

Nel 1943 il rettore Francesco Bertoglio nascose nel seminario 65 ebrei, salvandoli così dalla deportazione ad Auschwitz. Per questo, Bertoglio fu onorato nel 2011, postumo, del titolo di Giusto tra le nazioni.

La sede attuale si affaccia sulla piazza antistante la basilica di Santa Maria Maggiore, nel rione Esquilino, fu inaugurata da papa Paolo VI giovedì 11 novembre 1965. La prima pietra di questa sede totalmente rinnovata era stata posta pochi anni prima - il 10 febbraio 1963 - dall'allora card. Montini.

Dal 2003 la comunità del Seminario Lombardo è arricchita dalla presenza delle Povere Suore di Nostra Signora (Poor Sisters of Our Lady), religiose provenienti dall'India.